小鼠檸檬酸桿菌感染模型常用于研究腸病原體腸致病性大腸桿菌（EPEC）和腸出血性大腸桿菌（EPEC）。鼠檸檬酸桿菌感染C57BL/6小鼠，可以產生類似腸毒素大腸桿菌產生的腸毒素，引起敗血癥。

本實驗采用昆明種6-8周齡的健康成年小鼠，體重均在33±2g，SPF級。飼料墊料均為高壓滅菌產品，購自北京斯貝福生物科技股份有限公司，動物用水為實驗室制UP水經過除菌處理。飼養及實驗操作均于具有檢驗合格資質的SPF級屏障動物室內進行，并且實驗動物以完整的包裝直接進入屏障實驗室，觀察室適應7天后無異常情況，方可進行實驗。所有實驗中小鼠均引頸處死，盡量減少動物手術創傷程度及失血量。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學規范，對環境和生態影響等符合國家相關法律規定。

C. rodentium經口腔灌胃進入小鼠體內，首先在盲腸部位粘附，與腸道內共生菌競爭，大量繁殖，產生類似于腸出血性大腸桿菌產生的腸毒素，引起敗血癥。 小鼠感染后可能會排出軟便，出現腸上皮細胞增生、腹瀉、結腸炎等癥狀，大部分增生性病變發生在下行結腸，年輕小鼠尤其近交系死亡率較高，存活鼠可能會出現直腸垂脫。病理表現包括上皮過度增生和中性粒細胞浸潤。

單次灌胃1011CFU檸檬酸桿菌感染小鼠。

1. 研究目的及意義

本實驗動物造模方法采用噁唑酮（oxazolone, OXZ）、2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS）序貫給藥灌腸，誘導制備小鼠遷延性潰瘍性結腸炎模型，區別于單用噁唑酮或2,4,6-三硝基苯磺酸等化學藥品造成的急性模型，癥狀和病理變化僅維持3-5天，而本方法可維持1-2個月，大大的延長了模型的持續時間，同時也提高了造模的穩定性和所模擬疾病特征性病變的持久性，更符合臨床潰瘍性結腸炎慢性遷延、反復發作的特征，對開展潰瘍性結腸炎病因、病機和治療藥物的相關動物實驗研究具有重要意義。

2. 潰瘍性結腸炎動物模型的國內外研究進展

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis, UC）又稱慢性非特異潰瘍性結腸炎，與克羅恩病同屬于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease, IBD）[1-2]，其病因及發病機制至今尚未明確，目前國內外研究主要集中于免疫、遺傳、環境及感染等因素，患者臨床以粘液、膿血便等消化系統的癥狀為主，病情反復發作，遷延不愈，嚴重影響著患者的生活質量，甚至可能導致結腸癌[3]。UC的顯微鏡下病理特征主要為：隱窩結構異常，上皮細胞異常以及炎癥浸潤。黏膜炎癥彌漫性分布，發病時主要臨床表現為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重，并出現血沉、中性粒細胞及嗜酸性粒細胞的增多[4]。人類潰瘍形成是個緩慢的過程，由于其難愈性、易復發性的特點而成為現代難治性疾病之一。目前關于該疾病的實驗室研究模型尚不成熟，且多為急性損傷和病理模擬，缺乏良好的慢性長期的動物模型，無法準確的反映人類臨床UC慢性遷延、反復發作的特點[5]。建立UC動物模型實驗動物的選擇很廣泛，大鼠、小鼠、兔等多種實驗動物都可，但方法各不相同。目前存在的造模方法有如下幾種：

2.1 化學法

2.1.1 乙酸刺激

楊永剛[6]等人采用乙酸灌腸成功建立潰瘍性結腸炎模型，張忠[7]用經肛門注入0.5 g/L肥皂水0.15 mL, 約30 min后用2g/L戊巴比妥鈉經腹腔麻醉，插入直徑3 mm的聚乙烯纖維導管至小鼠直腸內深度約為1~2 cm，注入8%乙酸溶液0.15 mL的方法，結果乙酸組結腸黏膜上皮細胞萎縮、壞死、脫落，成腸壁變薄，皺襞消失，黏膜下淋巴細胞增生并有淋巴濾泡形成。張曉峰[8]研究發現乙酸誘導UC動物模型的作用機理與乙酸直接刺激使血管通透性增加，激肽激活，溶解纖維蛋白活性增加以及凝血機制障礙有關。乙酸誘導UC模型制作方法簡單，成本低，短期內可使小鼠出現UC明顯的癥狀及典型病理變化，是目前實驗性UC模型中應用最廣泛的模型之一，適合于臨床研究UC的發病機制以及新藥的研制開發。但由于乙酸直接刺激造成結腸黏膜和血管的損傷，與臨床致病因素有較大差異，且最初黏膜損傷的非特異性炎癥呈現急性過程，不能表現人類UC所具有的慢性，復發的特點[9]。

2.1.2 DSS法

葡聚糖硫酸鈉 (dextran sulphate sodium,DSS) 是一種肝素樣硫酸多糖體，1958 年Ohkusa[10]最早利用倉鼠建立，閆曙光[11]采用2%葡聚糖硫酸鈉口服2周建立潰瘍性結腸炎小鼠模型，Trivedi [12]通過給Swiss小鼠連續7d自由飲用3.0%DSS水溶液，之后連續14d給予普通飲水，最后再連續7d給予3.0%DSS水溶液建立DSS的慢性UC模型。但是DSS誘導的潰瘍模型個體差異比較明顯，且為短期急性模型，不適宜研究慢性UC引發的結腸癌相關問題。

2.2 復合法

2.2.1 惡唑酮模型(oxazolone,OXZ)+乙醇

惡唑酮是一種半抗原物質[13]，其誘導UC模型先致敏然后進行灌腸給藥，用惡唑酮溶液對小鼠灌腸,小鼠5d后即可出現腸道炎癥[14]，結腸肉眼可見黏膜充血水腫, 糜爛潰瘍, 鏡下見結腸黏膜潰瘍。7d左右病情好轉，10d左右基本痊愈。利用惡唑酮建立潰瘍性結腸炎模型，速度較快，重復性好且制作簡單，但是疾病維持時間相對較短，小鼠模型有自愈傾向，缺少慢性過程，對于慢性復發性潰瘍性結腸炎的模擬度不高。

2.2.2 三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)+乙醇

采用異戊巴比妥麻醉，一定量TNBS緩慢灌腸可以誘導急性腸炎Wistar大鼠模型；15d以后再次給予定量TNBS灌腸可以造成復發性結腸炎，可以造成復發性結腸炎[15-16]，三硝基苯磺酸與乙醇灌腸一次致炎是目前最為常用的潰瘍性結腸炎模型建立方法，具有以上其他建模方法所沒有的優點。

2.3 免疫復合法

2.3.1 免疫復合物+TNBS+乙醇

譚琰等[17]實驗證實，與TNBS+乙醇誘導的結腸炎動物模型相比，增加免疫復合物進行復合誘導的方式更符合T/B淋巴細胞混合作用的要求，而且炎癥持續的時間延長了3~4個星期。崔國寧[18]研究免疫復合法建立的大鼠UC模型表現穩定，重復性好，病變持久，發病機制與人類UC相似，是較為理想的模型。康宜兵等[19]研究示免疫復合建立的模型成功率高，重復性好，與人類的UC相似，是較為理想的模型。具體方法：取20只SD大鼠，隨機分為模型組和空白組，每組各10只，模型組給予抗原乳化液于大鼠的背部、頸部皮下，第23天灌腸TNBS/50%乙醇，空白組以生理鹽水代替，比較各組大鼠的大便性狀、體重、便血等，并進行組織學檢查。由此可以看出，本法建立大鼠 UC 模型持續的時間長，潰瘍的形成，與炎性反應都有體現，符合臨床UC的病理要求，但缺點是比較繁瑣。

2.3.2 免疫復合物+乙酸

吳玉泓[20]采用局部乙酸刺激替代TNBS+乙醇灌腸，免疫致敏方法與上述相似，同樣起到了模擬人類UC慢性活動性的特點，也適宜于觀察和評價藥效。

2.4 討論

UC模型最常見的造模方法為化學法、復合法及免疫復合法等，DSS液、TNBS液是化學法中最常用的誘導劑，對造模成功與否所用到的評價指標主要有：疾病活動指數、結腸指數、結腸組織大體評分[21-22]、MPO酶活性檢測[23]，以及形態學觀察和免疫組化學染色細胞觀察[24-25]等。目前對于潰瘍性結腸炎動物模型的誘導大部分屬于急性病發式炎癥，偶有慢性模型誘導的方法，雖然現在建造UC動物模型的方法多種多樣，但是依舊存在著或多或少的缺陷，現階段的UC模型遠不能滿足科學研究的需要，故尋找更好，更方便，更符合人類潰瘍疾病的模型尤為重要。本實驗方法[26-27]將OXZ與TNBS聯合灌腸給藥，按照一定周期誘導小鼠潰瘍性結腸炎模型可維持一個月，使UC模型更接近人類UC發病機制及臨床癥狀，通過控制小鼠的性別、體重、健康飼養狀況、實驗環境與條件等環節，觀察小鼠的行為改變情況、免疫組化、炎癥因子的表達情況，為進一步研究UC的發病機制，防治方法提供符合臨床實際的、標準的、可重復的、可控易行的實驗動物模型，為慢性潰瘍性結腸炎模型的研究提供了可靠的數據支持和實驗依據，是臨床UC治療藥物研究的重要基礎。

參考文獻

[1] 張晶娜,陶磊,張俊,王木嶺,陳瑩,劉衡,張成桂,何苗.美洲大蠊提取物Ento-A對濕熱型潰瘍性結腸炎模型大鼠的改善作用研究[J].中國藥房,2020,31(01): 35-41.

[2]趙曼, 高峰. 潰瘍性結腸炎發病機制研究進展[J]. 現代生物醫學進展, 2010, 10(16): 3160-3165.

[3]Lakatos PL, Lakatos L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis:changes, causes and management strategines [J]. World J Gastroenterol, 2008,14(25): 3937-3947.

[4]郭 倩, 唐志鵬, 王麗娟. 潰瘍性結腸炎組織病理學診斷的研究進展[J]. 世界華人消化雜志, 2014, 22(2): 190-196.

[5]鄭文瀟,吳翔.潰瘍性結腸炎動物模型的研究進展[J].中國病原生物學雜志,2016, 11(09):861-864+867.

[6]楊永剛,王丹丹,張艷秋,王明星.猴頭菌多糖對潰瘍性結腸炎模型大鼠腸道短鏈脂肪酸含量的影響[J].中國藥房,2019,30(20):2763-2767.

[7]張忠,程富勝,賈寧,車清明,尹鳳琴,祝艷華.小鼠潰瘍性結腸炎模型的建立及病理組織學比較[J].中國實驗動物學報,2012,20(06):69-72+99.

[8]張曉峰.細胞因子與潰瘍性結腸炎[J].河北醫學, 2001, 7 (5) :465-467.

[9]霍麗娟, 趙和平.實驗性潰瘍性結腸炎大鼠模型的研究[J].山西醫科大學學報, 2004, 35 (5) :467-470.

[10] 閆曙光,惠毅,李倩,李京濤,魏海梁.黃連-干姜提取物對潰瘍性結腸炎小鼠結腸上皮TLR4/NF-κB信號通路的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2020,26(04): 70-75.

[11]Ohkusa T. Production of experimental ulcerative colitis in hamsters by dextransulfate sodium and changes in intestinal microflora[J].Nihon Shokakibyo GakkaiZasshi,1985,82(5):1327-36

[12] Trivedi PJ,Bruns T,Ward S,et al.Intestinal CCL25expression is increased in colitisand correlates with inflammatory activity[J].J Autoimmun,2016(68): 98-104

[13] Friedlaender M H, Cyt R, Contactsensitivity in the guinea pig eye[J].Curr Eye

Res,1981, 1 (7) :403.

[14] 沈可欣,馬淑榮,李巖,等.惡唑酮誘導小鼠炎性腸病模型的建立[J].中國實驗診斷學,2012(10):1804-6.

[15] Wang YH,Ge B,Yang XL,etal.Proanthocyanidins from grape seeds modulates the nuclear factor-kappa Bsignal transduction pathways in rats with TNBS-induced recurrent ulcerativecolitis[J].Int Immunopharmacol,2011,11 (10):1620-7.

[16] Li XL,Cai YQ,Qin H,et al.Therapeuticeffect and mechanism of proantho- cyanidins from grape seeds in rats withTNBS-induced ulcerative colitis[J].Can J Physiol Pharmacol,2008,86(12):841-9.

[17]譚琰,三硝基苯磺酸/乙醇與免疫復和物聯合誘導的結腸炎動物模型及其免疫機制的探討[D].華中科技大學,2008.

[18]崔國寧,劉喜平,董俊剛,曾慶濤.潰瘍性結腸炎模型建立方法研究進展[J].今日藥學,2018,28(04):280-284.

[19]康宜兵,呂永慧,吳宇金,鐘志勇,武昕.免疫復合型潰瘍性結腸炎大鼠模型的實驗研究[J].云南中醫中藥雜志,2015,36(10):55-57.

[20]吳玉泓,李海龍,段永強,吳建軍,王宏偉,魏彥明.免疫致敏結合局部乙酸刺激法建立大鼠潰瘍性結腸炎模型[J].中國實驗動物學報,2010,18(01):65-68+65.

[21]Graeme P Young，D.James B.St John，Sidney J Winawer，et al.Choice of fecal occult blood tests for colorectalcancer screening: recommendations based on performance characteristics inpopulation studies[J]. The American Journal ofGastroenterology. 2002 (10)

[22]Wang Zhi-xue，DongBing，Feng Zi-fang，et al. A study on immune- omodulatory mechanism ofpolysaccharopeptide mediated by TLR4 signaling pathway[J]. BMC Immunol，2015，16（1）：34.

[23]Itana de Mattos，Pintoe Passos，Renata Lopes Britto.Diagnosisand treatment of müllerian malformations[J].Taiwanese Journal of Obstetrics & Gynecology, 2020, 59(2).

[24]徐立,胡瑞斌,李兆波,等. STZ誘導糖尿病大鼠胰腺及肝臟石蠟切片HE染色改進方法[J].臨床與實驗病理學雜志,2019,35(09):1122-1124.

[25] Hilip Alex，Nicholas C Zachos，Thuan Nguyen，et al. Distinct cytokinepatterns identified from multiplexprofiles of murine DSS and TNBS-induced colitis[J]. NIH Public AccessAuthor Manuscript，2009，15（3）：341-352.

[26]宋曉敏,張丹參,莊忠寶,張海威,蘇曉梅,趙凱燕,張力.噁唑酮與三硝基苯磺酸聯用誘導小鼠慢性潰瘍性結腸炎模型[J].神經藥理學報,2016,6(03):17-23.

[27] 張丹參,王倩,田慧,薛貴平,張力.大黃栓制劑對兩種潰瘍性結腸炎模型小鼠的作用研究[J].神經藥理學報,2015,5(01):19-37.